아가 로스 겔 전기 영동 - Agarose gel electrophoresis

3 개의 플라스미드 제한 다이제스트의 디지털 이미지는 ethidium bromide로 염색 된 1 % w / v agarose gel, 3 volt / cm에서 실행됩니다. DNA 크기 마커는 상용 1kbp 사다리입니다. 우물의 위치와 DNA 이동 방향이 기록됩니다.

아가 로스 겔 전기 영동한천 의 두 가지 주요 성분 중 하나 인 아가 로스 매트릭스에서 DNA 또는 단백질과 같은 거대 분자의 혼합 집단을 분리하기 위해 생화학 , 분자 생물학 , 유전학임상 화학 에서 사용되는 겔 전기 영동 방법입니다 . 단백질은 전하 및 / 또는 크기 ( 등전 집속 아가 로스 전기 영동은 본질적으로 크기 독립적 임)에 의해 분리 될 수 있고 , DNARNA 단편은 길이에 따라 분리 될 수 있습니다 . [1] 전기장 을인가하여 생체 분자를 분리하전 된 분자를 아가 로스 매트릭스를 통해 이동시키고 생체 분자는 아가 로스 겔 매트릭스에서 크기별로 분리됩니다. [2]

Agarose 젤은 주조하기 쉽고, 상대적으로 더 적은 전하 그룹을 가지고 있으며, 특히 실험실에서 가장 자주 접하는 크기 범위의 DNA를 분리하는 데 적합합니다. 분리 된 DNA는 얼룩으로 볼 수 있으며, 가장 일반적으로 자외선 아래에서 볼 수 있으며 DNA 단편은 상대적으로 쉽게 겔에서 추출 할 수 있습니다. 사용되는 대부분의 아가 로스 겔은 적절한 전기 영동 완충액에 0.7–2 % 용해되어 있습니다.

아가 로스 젤의 특성

겔 전기 영동에 사용되는 트레이에 캐스트 된 아가 로스 겔

아가 로즈 겔은 생체 분자가 통과 할 수있는 채널과 기공이있는 3 차원 구조로 응집 된 슈퍼 코일 번들의 나선형 아가 로즈 분자로 구성된 3 차원 매트릭스입니다. [3] 3 차원 구조는 수소 결합과 함께 유지되므로 액체 상태로 다시 가열하면 파괴 될 수 있습니다. 용융 온도는 소스에 따라 겔화 온도와 다릅니다. 아가 로즈 겔의 겔화 온도는 35–42 ° C이고 용융 온도는 85–95 ° C입니다. 화학적 변형을 통해 만든 저 융점 및 저 겔화 아가 로스도 사용할 수 있습니다.

Agarose 겔은 기공 크기가 크고 겔 강도가 좋아 DNA 및 큰 단백질 분자의 전기 영동을위한 대류 방지 매체로 적합합니다. 1 % 겔의 기공 크기는 100nm에서 200 ~ 500nm로 추정되었으며 [4] [5] 겔 강도는 겔이 0.15 % 정도로 희석되어 겔 전기 영동을위한 슬래브를 형성 할 수 있도록합니다. [6] 저농도 겔 (0.1-0.2 %)을하지만 깨지기 때문에 취급이 어렵다. Agarose gel은 DNA 용 polyacrylamide gel보다 분해능이 낮지 만 분리 범위가 넓어 일반적으로 50–20,000bp 크기의 DNA 단편에 사용됩니다. 표준 아가 로스 겔 전기 영동의 분해능 한계는 약 750kb이지만 펄스 필드 겔 전기 영동 으로 6Mb 이상의 분해능이 가능합니다.(PFGE). [7] 또한 큰 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있으며 유효 반경이 5-10nm보다 큰 입자의 겔 전기 영동에 선호되는 매트릭스입니다. 0.9 % 아가 로즈 젤은 박테리오파지 T4 가 들어갈만큼 충분히 큰 구멍을 가지고 있습니다. [6]

아가 로스 폴리머는 하전 된 그룹, 특히 피루 베이트황산염을 포함 합니다. [8] 이 음으로 하전 된 그룹 호출 처리에 DNA의 움직임과 반대 방향으로 물 흐름을 생성 electroendosmosis (EEO), 따라서 DNA의 밴드의 흐려질 이동을 지연시킬 수있다. 더 높은 농도의 겔은 더 높은 전기 내이동 흐름을 가질 것입니다. 따라서 낮은 EEO 아가 로스는 일반적으로 핵산의 아가 로스 겔 전기 영동에 사용하는 데 선호됩니다., 그러나 높은 EEO 아가 로스는 다른 목적으로 사용될 수 있습니다. 낮은 EEO 아가 로스, 특히 저 융점 (LMP) 아가 로스의 낮은 황산염 함량은 오염 황산염의 존재가 일부 후속 절차에 영향을 미칠 수 있으므로 겔에서 추출 된 DNA를 추가 조작에 사용하는 경우에도 유용합니다. 같은 결찰PCR . 그러나 제로 EEO 아가 로스는 양전하를 띤 그룹을 추가하여 만들 수 있으며 이러한 그룹은 후속 효소 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 일부 응용 분야에서는 바람직하지 않습니다. [9] Electroendosmosis은 아가 로스 우선적으로 사용되는 이유이다 한천 은 AS 펙틴은한천의 성분은 상당량의 음으로 하전 된 황산염 및 카르복실기를 포함합니다. 아가 로스에서 아가로 펙틴의 제거는 EEO를 실질적으로 감소시킬뿐만 아니라 겔 매트릭스에 대한 생체 분자의 비특이적 흡착을 감소시킵니다. 그러나 혈청 단백질의 전기 영동과 같은 일부 응용 분야의 경우 높은 EEO가 바람직 할 수 있으며 사용되는 겔에 아가로 펙틴을 첨가 할 수 있습니다. [10]

아가 로스 겔에서 핵산의 이동

겔 내 핵산 이동에 영향을 미치는 요인

플라스미드 제제의 겔은 일반적으로 동일한 레인에서 다른 희미한 밴드와 함께 수퍼 코일 DNA의 주요 밴드를 보여줍니다. 일반적으로 DNA 젤은 젤 바닥에 더 가까운 작은 DNA 조각으로 표시됩니다. 이것은 역사적으로 DNA 겔이 수직으로 실행되었고 더 작은 DNA 조각이 더 빨리 아래쪽으로 이동하기 때문입니다.

다양한 요인이 핵산의 이동에 영향을 미칠 수 있습니다 : 겔 기공의 크기 (겔 농도), 전기 영동되는 DNA의 크기, 사용 된 전압, 완충액의 이온 강도,에 티듐 브로마이드와 같은 삽입 염료의 농도 전기 영동 중에 사용하는 경우. [11]

작은 분자는 젤의 큰 분자보다 빠르게 이동하고 이중 가닥 DNA는 염기 쌍 수의 로그에 반비례하는 속도로 이동합니다. 그러나이 관계는 매우 큰 DNA 조각으로 무너지고, 매우 큰 DNA 조각을 분리하려면 서로 다른 두 방향에서 교류를 적용하는 펄스 필드 젤 전기 영동 (PFGE)을 사용해야 하며 큰 DNA 조각은 변화하는 전류. [12]

표준 아가 로스 겔 전기 영동의 경우, 더 큰 분자는 저농도 겔을 사용하여 더 잘 분리되는 반면 작은 분자는 고농도 겔에서 더 잘 분리됩니다. 그러나 고농도 젤은 더 긴 작동 시간 (때로는 며칠)이 필요합니다.

DNA의 움직임은 DNA 분자 형태의해 영향을받을 수 있습니다. 예를 들어, supercoiled DNA는 일반적으로 이완 된 DNA보다 빠르게 움직입니다. 정상적인 플라스미드 DNA 준비에서는 여러 형태의 DNA가 존재할 수 있습니다. [13] 칼자국 DNA (오픈 원형)과 완화 된 닫힌 원형 사소한 밴드로 나타나는 동안 플라스미드 겔 전기 영동은 일반적으로, 주 대역과 같은 음으로 수퍼 코일 형태를 표시한다. 그러나 다양한 형태가 움직이는 속도는 다른 전기 영동 조건을 사용하여 변할 수 있으며 [14] 더 큰 원형 DNA의 이동성은 겔의 기공 크기에 의해 선형 DNA보다 더 강하게 영향을받을 수 있습니다. [15]

원형 DNA에 삽입되는 Ethidium bromide는 DNA 분자의 전하, 길이 및 초 나선 성을 변화시킬 수 있으므로 전기 영동 중에 겔에 존재하면 움직임에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, ethidium bromide의 양전하는 DNA 이동을 15 %까지 줄일 수 있습니다. [12] 아가 로스 겔 전기 영동 다른 수퍼 코일 토폴로지 원형 DNA를 해결하기 위해 사용될 수있다. [16]

증가 된 교차 결합 으로 인한 DNA 손상 은 또한 용량에 따라 전기 영동 DNA 이동을 감소시킵니다. [17] [18]

DNA의 이동 속도는 적용된 전압에 비례합니다. 즉, 전압이 높을수록 DNA가 더 빨리 이동합니다. 그러나 큰 DNA 조각의 해상도는 고전압에서 더 낮습니다. DNA의 이동성은 또한 불안정한 장에서 변할 수 있습니다. 주기적으로 역전되는 장에서는 특정 크기의 DNA 이동성이 특정주기 주파수에서 크게 떨어질 수 있습니다. [4] 이 현상은 더 큰 DNA 단편은 작은 것보다 더 빨리 이동된다 필드 반전 겔 전기 영동 (FIGE)의 밴드 반전을 초래할 수있다.

마이그레이션 이상

  • "Smiley"젤-이 가장자리 효과는 적용된 전압이 사용 된 젤 농도에 비해 너무 높을 때 발생합니다. [19]
  • DNA 과부하-DNA 과부하는 DNA 단편의 이동을 느리게합니다.
  • 오염-염분이나 단백질과 같은 불순물의 존재는 DNA의 움직임에 영향을 미칠 수 있습니다.

마이그레이션 및 분리 메커니즘

인산염 백본의 음전하는 전기 영동 동안 DNA를 양전하를 띤 양극쪽으로 이동시킵니다. 그러나 겔 매트릭스가 없을 때 용액에서 DNA 분자의 이동은 전기 영동 동안 분자량과 무관합니다. [4] [20] 겔 매트릭스는 전기 영동시 크기별로 DNA의 분리에 따라서, 책임 및 모델 번호 겔 매트릭스의 생체 분자의 분리의 메커니즘을 설명하기 위해 존재한다. 널리 받아 들여지는 것은 폴리머 매트릭스를 체로 취급하는 Ogston 모델입니다. 구형 단백질 또는 무작위 코일DNA는 상호 연결된 기공을 통해 이동하고, 더 큰 분자의 이동은 겔 매트릭스와의 충돌로 인해 지연되고 느려질 가능성이 높으므로이 체질 과정에서 서로 다른 크기의 분자를 분리 할 수 ​​있습니다. [4]

그러나 Ogston 모델은 기공이 분자 크기보다 훨씬 작은 큰 분자에 대해 분해됩니다. 크기가 1kb 보다 큰 DNA 분자의 경우 reptation 모델 (또는 그 변형)이 가장 일반적으로 사용됩니다. 이 모델은 DNA가 긴 분자로서 기공을 통해 "뱀과 같은"방식 (따라서 "반복")으로 기어 갈 수 있다고 가정합니다. 편향된 반복 모델은 더 높은 전계 강도에 적용되며, 그 결과 분자의 앞쪽 끝이 순방향으로 강하게 편향되고 나머지 분자를 끌어 당깁니다. [21]그러나 염색 된 분자의 실시간 형광 현미경은 전기 영동 중에 더 미묘한 역학을 보였으며, DNA는 적용된 필드의 방향으로 교대로 늘어난 다음 공으로 수축하거나 U 자 모양으로 연결됨에 따라 상당한 탄력성을 보여줍니다. 폴리머 섬유에 걸릴 때. [22] [23]

일반 절차

아가 로스 겔 전기 영동 실험의 세부 사항은 방법에 따라 다를 수 있지만 대부분은 일반적인 절차를 따릅니다.

리그 조립 및 젤로드 / 실행을 보여주는 비디오.

젤 주조

다중 채널 피펫을 사용하여 DNA 샘플을 아가 로즈 겔의 우물에로드합니다.

겔은 전기 영동에 사용되는 적절한 완충액 (예 : TAE 또는 TBE)에 아가 로스 분말을 용해하여 제조됩니다. [24] 아가로 오스는 거의 비점 있지만 않도록 비등 가열 전에 버퍼에서 분산된다. 아가 로스 용액이 너무 뜨거우면 캐스트가 휘거나 갈라질 수 있으므로 용융 된 아가 로스는 용액을 캐스트에 붓기 전에 충분히 냉각되도록합니다. 샘플 로딩을위한 우물을 만들기 위해 캐스트에 빗을 놓고 사용하기 전에 젤을 완전히 설정해야합니다.

겔의 농도는 DNA 분리의 해상도에 영향을 미칩니다. 아가 로스 겔은 분자가 이동하는 미세한 기공으로 구성되어 있으며, 아가 로스 겔의 기공 크기와 농도 사이에는 역관계가 있습니다. 아가 로스 섬유의 밀도가 증가함에 따라 기공 크기가 감소합니다. 높은 겔 농도는 더 작은 DNA 분자의 분리를 향상시키는 반면, 겔 농도를 낮추면 큰 DNA 분자를 분리 할 수 ​​있습니다. 이 과정을 통해 사용 된 겔 농도에 따라 50 염기쌍에서 수 메가 염기까지의 단편을 분리 할 수 ​​있습니다. [25]농도는 사용 된 완충액 부피 (g / ml)에 대한 아가 로스의 중량으로 측정됩니다. 표준 아가 로스 겔 전기 영동의 경우, 0.8 % 겔은 큰 5 ~ 10kb DNA 단편의 우수한 분리 또는 분해능을 제공하는 반면, 2 % 겔은 작은 0.2 ~ 1kb 단편의 경우 우수한 분해능을 제공합니다. 1 % 겔은 종종 표준 전기 영동에 사용됩니다. [26] 높은 비율 젤은 종종 취성과 낮은 비율 젤 (0.1 ~ 0.2 %)을 쉽게 처리 할 수 연약하지 동안 균등하게 설정하지 않을 수 있습니다. 저 융점 (LMP) 아가 로스 겔은 일반 아가 로스 겔보다 더 취약합니다. 저 융점 아가 로스는 DNA 분리 및 분리를 위해 자체적으로 또는 표준 아가 로스와 동시에 사용할 수 있습니다. [27] PFGE와 FIGE은 종종 젤 아가로 오스 높은 비율로 수행됩니다.

샘플 로딩

젤이 설정되면 빗이 제거되고 DNA 샘플을로드 할 수있는 웰이 남습니다. 로딩 버퍼는 혼합물이 웰에 로딩되기 전에 DNA 샘플과 혼합됩니다. 로딩 버퍼에는 글리세롤, 수 크로스 또는 Ficoll같은 고밀도 화합물이 포함되어있어 샘플의 밀도를 높여 DNA 샘플이 우물 바닥으로 가라 앉을 수 있습니다. [28] DNA의 시료는 제조 후 잔류 에탄올을 포함하는 경우, 상기 웰의 아웃 떠있다. 로딩 버퍼에는 전기 영동의 진행을 모니터링하는 데 사용되는 자일 렌 시아 놀브로 모 페놀 블루같은 유색 염료도 포함됩니다 . DNA 샘플은 피펫을 사용하여로드됩니다 .

전기 영동

Agarose gel slab in electrophoresis tank with bands of dyes indicating progress of the electrophoresis. The DNA moves towards anode.

Agarose gel electrophoresis is most commonly done horizontally in a submarine mode whereby the slab gel is completely submerged in buffer during electrophoresis. It is also possible, but less common, to perform the electrophoresis vertically, as well as horizontally with the gel raised on agarose legs using an appropriate apparatus.[29] The buffer used in the gel is the same as the running buffer in the electrophoresis tank, which is why electrophoresis in the submarine mode is possible with agarose gel.

For optimal resolution of DNA greater than 2 kb in size in standard gel electrophoresis, 5 to 8 V/cm is recommended (the distance in cm refers to the distance between electrodes, therefore this recommended voltage would be 5 to 8 multiplied by the distance between the electrodes in cm).[14] Voltage may also be limited by the fact that it heats the gel and may cause the gel to melt if it is run at high voltage for a prolonged period, especially if the gel used is LMP agarose gel. Too high a voltage may also reduce resolution, as well as causing band streaking for large DNA molecules. Too low a voltage may lead to broadening of band for small DNA fragments due to dispersion and diffusion.[30]

DNA는 자연광에서는 보이지 않기 때문에 전기 영동의 진행은 유색 염료를 사용하여 모니터링됩니다. 크실렌 시아 놀 (연한 파란색)은 큰 DNA 조각을 압축하는 반면, 브로 모 페놀 블루 (진한 파란색)는 작은 조각과 압축합니다. 덜 일반적으로 사용되는 염료에는 브로 모 페놀 블루보다 먼저 이동하는 Cresol RedOrange G 가 있습니다. DNA 마커는 또한 DNA 단편의 분자량의 추정 함께 실행된다. 그러나 플라스미드와 같은 원형 DNA의 크기는 제한 다이제스트에 의해 선형화되지 않는 한 표준 마커를 사용하여 정확하게 측정 할 수 없으며 , 대안으로 슈퍼 코일 DNA 마커를 사용할 수 있습니다.

염색 및 시각화

UV 조명이있는 젤 :에 티듐 브로마이드로 염색 된 DNA 는 빛나는 주황색 밴드로 나타납니다.

DNA와 RNA는 일반적으로 ethidium bromide 로 염색하여 시각화 하는데, 이는 DNA의 주요 홈에 삽입되고 UV 광선 아래에서 형광을 발합니다. intercalation은 DNA의 농도에 따라 다르므로 강도가 높은 밴드는 강도가 낮은 밴드에 비해 DNA 양이 더 많음을 나타냅니다. 티듐 브로마이드는 겔화되기 전에 아가 로스 용액에 첨가 될 수 있고, DNA 겔은 전기 영동 후 나중에 염색 될 수있다. 젤의 얼룩 제거는 필요하지 않지만 더 나은 이미지를 생성 할 수 있습니다. 다른 염색 방법을 사용할 수 있습니다. 예는 SYBR Green , GelRed , methylene blue , brilliant cresyl blue , Nile blue입니다.황산염, 크리스탈 바이올렛 . [31] 가되도록 도시 된 바와 같이 SYBR 그린 GelRed 및 기타 유사한 시판품 티듐 브로마이드 안전한 대안으로 판매되는 돌연변이에임스 시험 있지만 발암 에티 디움 브로마이드를 실제로 확립되어 있지 않다. SYBR Green은 청색광 트랜스 일루미네이터를 사용해야합니다. 크리스탈 바이올렛으로 염색 된 DNA는 UV transilluminator를 사용하지 않고 자연광 아래에서 볼 수 있다는 장점이 있지만 강한 밴드를 생성하지 못할 수 있습니다.

When stained with ethidium bromide, the gel is viewed with an ultraviolet (UV) transilluminator. The UV light excites the electrons within the aromatic ring of ethidium bromide, and once they return to the ground state, light is released, making the DNA and ethidium bromide complex fluoresce.[12] Standard transilluminators use wavelengths of 302/312-nm (UV-B), however exposure of DNA to UV radiation for as little as 45 seconds can produce damage to DNA and affect subsequent procedures, for example reducing the efficiency of transformation, in vitro transcription, and PCR.[32]그러므로 UV 방사선에 대한 DNA의 노출은 제한되어야합니다. 365nm (UV-A 범위)의 더 높은 파장을 사용하면 DNA 손상이 줄어들지 만 ethidium bromide로 훨씬 약한 형광이 생성됩니다. transillumintor에서 여러 파장을 선택할 수있는 경우 이미지를 캡처하는 데 더 짧은 파장이 사용되는 반면, 장기간 젤에서 작업해야하는 경우 더 긴 파장을 사용해야합니다.

트랜스 일루미네이터 장치는 또한 젤의 이미지를 촬영하거나 인쇄 할 수있는 디지털 또는 폴라로이드 카메라와 같은 이미지 캡처 장치를 포함 할 수 있습니다.

단백질의 겔 전기 영동을 위해 밴드는 Coomassie 또는 silver stain 으로 시각화 할 수 있습니다 .

아가 로즈 젤 조각을 잘라냅니다. UV transilluminator를 사용할 때는 보호 장비를 착용해야합니다.

다운 스트림 절차

분리 된 DNA 밴드는 종종 추가 절차에 사용되며, DNA 밴드는 젤에서 슬라이스로 잘라내어 용해 및 정제 할 수 있습니다. 그러나 오염 물질은 PCR과 같은 일부 다운 스트림 절차에 영향을 미칠 수 있으며, 일부 효소 반응에 영향을 줄 수있는 황산염이 더 적기 때문에 일부 경우 저 융점 아가 로스가 선호 될 수 있습니다. 겔은 또한 블로 팅 기술에 사용될 수 있습니다.

버퍼

일반적으로 이상적인 버퍼는 전도성이 좋고 열이 적게 발생하며 수명이 길어야합니다. [33] , 아가 로스 전기 영동에 사용되는 버퍼의 개수가있다; 핵산에 대한 일반적인 것에는 Tris / Acetate / EDTA (TAE) 및 Tris / Borate / EDTA (TBE)가 포함됩니다. 사용 된 버퍼는 EDTA를 포함하여 기능을 위해 2가 양이온이 필요한 많은 뉴 클레아 제를 비활성화합니다. 붕산염이 RNA에서 발견되는 것과 같은 시스 디올과 중합 및 / 또는 상호 작용할 수 있기 때문에 TBE 완충액의 붕산염은 문제가 될 수 있습니다. TAE는 버퍼링 용량이 가장 낮지 만 더 큰 DNA에 대해 최상의 해상도를 제공합니다. 이것은 더 낮은 전압과 더 많은 시간을 의미하지만 더 나은 제품을 의미합니다.

많은 다른 완충액, 예를 들어 리튬 붕산염 (LB), 이소 전기 히스티딘, pK 매칭 상품 완충액 등 이 제안되었습니다 . 대부분의 경우 주장 된 근거는 더 낮은 전류 (더 적은 열) 및 또는 일치하는 이온 이동성이며, 이는 더 긴 버퍼 수명으로 이어집니다. Tris-phosphate buffer는 높은 완충 능력을 가지고 있으나 추출 된 DNA를 인산염에 민감한 반응에 사용할 경우 사용할 수 없습니다. LB는 비교적 새롭고 5kbp보다 큰 조각을 해결하는 데 효과적이지 않습니다. 그러나 전도도가 낮기 때문에 훨씬 더 높은 전압 (최대 35V / cm)을 사용할 수 있으므로 일상적인 전기 영동을위한 분석 시간이 더 짧아집니다. 매우 낮은 전도도 매질 (1mM 리튬 붕산염)을 사용하여 3 % 아가 로스 겔에서 염기쌍 크기 차이가 1 개만큼 낮습니다. [34]

다른 완충 시스템은 특정 응용 분야에서 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 바르비 투르 산-나트륨 바르비 투르 산염 또는 트리스- 바르비 투르 산염 완충액이 단백질의 아가 로스 겔 전기 영동, 예를 들어 단백질의 비정상 분포를 검출하는 데 사용될 수 있습니다. [35]

응용

Agarose 겔은 다른 매트릭스에 비해 쉽게 주조 및 취급되며 핵산은 전기 영동 중에 화학적으로 변경되지 않습니다. 샘플도 쉽게 회수됩니다. 실험이 끝나면 생성 된 젤은 냉장고의 비닐 봉지에 보관할 수 있습니다.

전기 영동은 전기장으로 인한 pH 변화를 줄이기 위해 완충액에서 수행되는데, 이는 DNA와 RNA의 전하가 pH에 의존하기 때문에 중요하지만 너무 오래 실행하면 용액의 완충 용량이 고갈 될 수 있습니다. 또한, 유전 물질의 다른 준비는 형태 학적 또는 다른 이유로 서로 일관되게 이동하지 않을 수 있습니다.

또한보십시오

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